侯勇哲 张琴 赵霄晨 何苗 鱼玲玲， 白海 吴涛
1甘肃中医药大学第一临床医学院（兰州730030）；
2中国人民解放军联勤保障部队第940 医院全军血液病中心（兰州730050）；
3甘肃省干细胞与基因药物重点实验室（兰州730050）
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由多种因素引起的肺部损伤并伴有严重的并发症，表现为进行性低氧血症、呼吸困难等［1］。近年来，ALI被重新定义为轻度或中度的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ARDS是由ALI 发展而来的复杂的级联过程［2］。误吸、肺挫伤、外伤和急性胰腺炎等多种因素均可引起ALI。发生ALI 时，患者肺泡毛细血管屏障遭到破坏，肺屏障通透性增加及肺组织内中性粒细胞浸润，最终发展为ARDS［3］。ALI/ARDS 病死率高达46%，针对ALI 的临床治疗主要采用机械通气等支持疗法暂时改善通气、缓解ALI 的相关症状［3-4］，尚无ALI/ARDS 特效治疗方案［5］。
干细胞是未分化的前体细胞，具有自我更新能力和分化为多谱系细胞的能力［6］，可以缓解ALI的病理状态且能控制ALI 症状［7］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一组来自骨髓、脂肪和脐带等组织，具有自我更新、多向分化和促进组织修复的成体干细胞［8］。目前，MSCs 在血液疾病、自身免疫性疾病和新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）等疾病的治疗方面显示出一定潜力［9］。而MSCs 来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）具有高稳定性，比MSCs 细胞疗法更安全且易于储存，是替代MSCs的无细胞治疗方法［10］。现对MSC-EVs 的分类和生物学特性、MSC-EVs 治疗ALI 的机制和临床试验的最新进展以及MSC-EVs 治疗ALI 的挑战作一综述，以期为MSC-EVs 在ALI 中的治疗应用提供新的思路。
MSCs 的免疫调节和再生作用部分是通过其释放的EVs 来实现的［11］。EVs 是一组异质性膜结合囊泡，根据直径的大小，主要分为三个亚群［12］：（1）直径在50 nm 到150 nm 的外泌体（exosomes，EXOs）是EVs 中数量最多的一种亚型，在多泡体（multivesicular body，MVB）与细胞膜表面融合时，通过胞吐作用释放到细胞外；
（2）直径在100 nm到1 000 nm 的微小囊泡（microvesicles，MVs）在不同细胞类型的细胞间信号传导中发挥作用，以质膜向外出芽的方式形成；
（3）直径在1 000 nm 到5 000 nm 的凋亡小体（apoptotic bodies，ABs）包含细胞器和非编码RNA，可能传递某些遗传信息，是细胞凋亡时释放的异质性囊泡［13-14］。MSC-EVs 作为一种高效的运输载体，含有多种蛋白、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和脂质等生物活性物质［12］，其主要特征是：（1）不能进行细胞增殖；
（2）不表达HLA-I 和HLA-II 抗原，没有免疫反应风险；
（3）体积小，可以通过小毛细血管；
（4）可以在负80 ℃下未使用二甲基亚砜储存时仍可保持生物活性［15］。目前研究表明，MSC-EVs 具有抗炎抗凋亡、修复组织细胞和免疫调节等生物学功能，在ALI 的治疗中具有良好的应用前景［16］。
尽管围绕MSCs 在ALI 中的治疗作用已经存在较多研究，但关于MSC-EVs 在ALI 中的作用机制却未明确［17］。ALI 的发病机制复杂，目前研究认为MSC-EVs 通过携带的内容物发挥对ALI 的治疗作用。MSC-EVs 通过与靶细胞膜上的受体相互结合并融入细胞膜或被内吞进入细胞内从而释放其内容物，转移生物活性物质如RNA 和蛋白质等［18］。
2.1 MSC-EVs 通过调节巨噬细胞治疗ALI 的机制ALI 常伴严重的肺泡毛细血管损伤，研究证明MSC-EVs 可以促进巨噬细胞极化为抗炎作用较强的M2 样表型，有助于炎症消退和组织修复［19］。
PHINNEY 等［20］研究发现，MSC-EVs 通过转移miRNA 来调节Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）的表达，使巨噬细胞耐受去极化的线粒体转移，从而起到保护巨噬细胞作用。MORRISON 等［21］发现，MSC-EVs 可通过转移线粒体促进巨噬细胞从M1 表型（分泌促炎因子）变为M2 表型（分泌抗炎因子），继而调节ARDS 小鼠模型中的巨噬细胞，且经过MSC-EVs 预处理的肺泡巨噬细胞可减少小鼠炎症表现，对肺损伤具有保护作用。VARKOUHI 等［22］发现，相比初始MSC-EVs，经干扰素γ培养的人脐带来源的MSC-EVs 可以更有效地减轻了大肠杆菌诱导的ALI，该作用可能是通过增强巨噬细胞吞噬作用和巨噬细胞对大肠杆菌的杀伤能力来介导的。赵瑞婧等［23］研究发现，MSC-EVs 对ALI 的抗氧化和抗炎作用是因为MSC 来源的EXOs（MSC-EXOs）可以促进巨噬细胞向M2 型转变，该作用主要通过其对Nrf2/Keap1/ARE 信号通路及TLR4/NF-κB 信号通路的调控进而发挥作用。HUANG 等［24］研究发现，年轻个体来源的MSC-EVs在ALI 小鼠模型中表现出保护作用，而老年个体来源的MSC-EVs 没有表现出保护作用，认为年轻和老年个体来源的MSC-EVs 携带的与巨噬细胞极化相关的几种miRNA 水平存在差异。此外，老年个体来源的MSC-EVs 不能促进巨噬细胞向M2 型转变及减少体内巨噬细胞募集。
2.2 MSC-EVs 通过miRNA 治疗ALI 的机制在ALI 的肺泡腔中存在大量中性粒细胞，使肺细胞受到损害，而MSC-EVs 具有修复肺上皮和内皮细胞的潜力［12］。ALI 可导致肺部过度炎症和肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AEC）凋亡并最终导致肺纤维化。MSC-EVs 可分泌miRNA，从而达到对ALI 的治疗保护作用。
在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导ALI小鼠模型中，MSC-EVs 将miR-27a-3p 转移到巨噬细胞并诱导M2 巨噬细胞极化，减轻了ALI 的症状［25］；
YI 等［26］证实MSCs-EXOs 分泌的miR-30b-3p抑制了AEC 中血清淀粉样蛋白A3 的表达，促进AEC 的增殖并抑制其凋亡，从而对ALI 提供保护作用；
XIAO 等［27］发现MSC-EXOs 可传递miRNA（miR-23a-3p 和miR-182-5p）到小鼠肺上皮细胞MLE-12，进而通过抑制Ikbkb 和失活IKKβ 以阻碍NF-κB 和hedgehog 信号通路，从而逆转经过LPS 处理的MLE-12 细胞上皮间质转化过程；
WEI 等［28］发现MSCs-EXOs 释放的miR-377-3p 通过靶向mTOR信号通路诱导自噬以减轻ALI 炎症反应。LIU等［29］研究发现，骨髓来源的MSCs-EVs 将miR-384-5p 转移到肺泡巨噬细胞中，进而下调Beclin-1 来恢复肺泡巨噬细胞的自噬反应障碍。此外，CHEN等［30］研究发现，MSC 来源的MVs（MSC-MVs）含有大量的miR-100，miR-100 可以通过恢复mTOR 信号增强自噬从而抑制博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的大鼠ALI 模型的细胞损伤和肺纤维化，改善了ALI 的炎性反应和细胞凋亡。综上，MSC-EVs可通过携带miRNA 参与细胞内通信和物质运输，可能对靶细胞具有炎症和免疫调节能力，从而为ALI 带来治疗价值。
2.3 MSC-EVs 通过细胞因子治疗ALI 的机制ALI 中的促炎细胞因子和趋化因子水平升高，MSCEVs 可降低促炎细胞因子水平并对肺细胞具有保护作用［31］。
CHEN 等［32］研究发现，MSC-MVs 可通过肝细胞生长因子的递送激活PI3K/AKT/mTOR 通路，逆转肺组织的细胞凋亡和纤维化，继而对BLM 诱导的小鼠ALI 发挥治疗作用。TANG 等［33］发现，MSC-MVs 含有大量的血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）mRNA，在LPS 诱导的ALI 小鼠模型气管中给予MSC-MVs 后，肺泡中Ang-1 蛋白的表达上调，使促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌被抑制而抗炎细胞因子白介素10（interleukin-2，IL-10）的分泌增多，进而改善了肺部炎症并恢复了肺毛细血管通透性；
然而给予缺乏Ang-1 mRNA 的MSC-EVs却导致支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞流入量和巨噬细胞炎症蛋白2 水平分别增加了136%和105%，肺部炎症恶化及肺毛细血管通透性恢复失败，提示MSC-EVs可以通过Ang-1 mRNA 对ALI 产生治疗作用。此外，MORRISON 等［34］也发现，MSC-EVs 显著降低了促炎细胞因子TNF-a 和IL-8 的产生。由此可见，MSC-EVs 对ALI 的治疗具有一定的潜力，但EVs 的载物和功效具有多样性，需要进一步研究EVs 的哪些组成部分发挥了治疗作用，以更好地利用EVs。
2.4 MSC-EVs通过线粒体转移治疗ALI的机制ALI 涉及线粒体氧化应激反应失衡机制，MSC-EVs中携带的线粒体可以转移到AEC，从而减轻氧化应激损伤和减少肺上皮细胞损伤［35］。
PHINNEY 等研究发现，MSC-MVs 中的线粒体转移到ALI 肺组织内的巨噬细胞，增强了巨噬细胞的吞噬功能［20］。此外，在LPS 诱导的小鼠ALI 模型中，ISLAM 等［36］首次发现，MSC-EVs 来源的线粒体转移到AEC 后，可为受损细胞“提供”新鲜的线粒体，从而增强细胞生物能量学并介导AEC 的ATP 生成；
MORRISON 等［21］也发现，EVs 转移的功能性线粒体可引起小鼠肺泡巨噬细胞内的氧化磷酸化水平增高，导致巨噬细胞的抗炎和吞噬作用增强并减轻ALI 损伤；
SILVA 等［37］最新研究发现，MSC-EVs 通过将线粒体嵌入内源性线粒体网络来恢复线粒体功能和线粒体呼吸，从而改善肺泡-毛细血管屏障功能并减轻肺损伤。目前针对MSCEVs 来源线粒体的研究较少，MSCs-EVs 来源线粒体对肺细胞功能和线粒体依赖性抗氧化代谢反应的影响值得进一步研究。
基于MSC-EVs 在各种ALI 动物模型中疗效的有力证明，现有研究者进行了MSC-EVs 临床转化的临床试验。COVID-19 会导致严重的ARDS，ZHU等［38］开展了一项针对MSC-EXOs吸入治疗重症COVID-19 的临床试验研究（NCT04276987），结果发现重症COVID-19患者吸入MSC-EXOs是安全的，且耐受性良好。另一项对照试验（NCT04798716）中，研究者通过静脉注射MSC-EXOs 来评估其在重症ARDS 患者中的安全性和有效性，截至目前试验正在进行［39］。此外，一项随机双盲临床试验（NCT04602104）旨在探讨雾化的MSC-EXOs 治疗ARDS 的治疗效果，截至目前试验结果尚未公布。SHI 等［40］开展了一项关于健康志愿者气溶胶吸入MSC-EXOs的耐受性临床试验研究（NCT04313647），评估了MSC-EXOs 的安全性和耐受性，结果表明志愿者对MSC-EXOs 耐受性较好且未表出现不良反应，为促进雾化MSC-EVs 在肺部疾病中的临床应用提供了初步证据。以上的临床试验展现出了MSC-EVs 在ALI/ARDS 的临床应用中具有良好的前景，然而，MSC-EVs的临床应用仍面临一些挑战。
目前在临床中使用MSC-EVs 作为治疗ALI 方法仍存在挑战：（1）目前结论多来自人为制造的动物ALI 模型（主要是啮齿动物），在将研究成功应用到人类之前，必须考虑人类ALI 患者与动物ALI模型以及基因调控、表达和发育及表观遗传因素之间的差异［40］；
（2）目前已有多种提取EVs 的技术，但不同的技术可能会对EVs 的功能产生影响，且EVs 的给药数量影响ALI 治疗效果［41］，因此未来需要标准化的EVs 采集和纯化方法以及开发更多用于大规模EVs 生产的技术；
（3）MSC-EVs 携带的miRNA、mRNA 和蛋白质等物质和MSCs 携带的物质存在不同，可能会在ALI 治疗中产生差异［42］，故精确测定可对ALI 发挥治疗作用的EVs 内容物有助于增强基于MSC-EVs 的疗效；
（4）关于MSC-EVs用于治疗ALI 的研究大多是短期的，因此其长期治疗效果尚不清楚，对人体的安全剂量也是未知的［12］，所以在ALI 中可实现最佳治疗反应的MSCEVs 的给药剂量和给药途径也有待确定［43］。
综上，ALI 是一种严重的临床综合征，可发展为死亡率较高的ARDS，目前尚无有效的治疗方法。MSCs 对ALI 具有一定的治疗潜力，但其治疗作用主要基于EVs 的转移。MSC-EVs 可以转移miRNA、mRNA、蛋白质和线粒体等多种物质，从而改善ALI 的症状。此外，MSC-EVs 与MSCs 相比具有体积更小、安全性较高、易于储存等特点，有望成为ALI 的无细胞治疗策略。但是，目前MSC-EVs相关的研究尚处于起步阶段，对MSC-EVs 及其亚型的释放、转运和发挥效应的机制仍不完全清楚，且大规模应用MSC-EVs 也存在挑战。因此，未来应进一步研究MSC-EVs 的功能及其机制，以期为临床治疗和防治ALI 提供理论依据。
【Author contributions】HOU Yongzhe and ZHANG Qin were responsible for the conception and wrote the article.ZHAO Xiaochen，HE Miao，and YU Lingling critically revised the manuscript.BAI Hai and WU Tao carefully polished the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.
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